PRÁCTICA 5: TINCIÓN DE GRAM
OBJETIVO
Diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) en función de la distinta composición de su pared bacteriana
FUNDAMENTO
Emplear el uso de diversos colorantes para poder diferenciar bacterias Gram + y Gram -
Material necesario:
1. Extensión
Lo primero que hicimos fue colocar en un portaobjetos limpio, seco y desengrasado, una gota de agua destilada utilizando el asa de platino previamente esterilizada en un mechero bunsen.
Luego tomamos asépticamente con el asa una pequeña muestra del cultivo sólido (aureus) y mezclar con la gota de agua para obtener una suspensión. Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.
NOTA: También puede utilizarse un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se toma con el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina o de agua.
Además flameamos el asa como ya indicamos en las prácticas anteriores y siempre trabajando cerca de la llama del mechero.
Nunca debemos olvidarnos de enfriar el asa antes de coger el microorganismo.
2. Desecación
La preparación se deja secar, a temperatura ambiente o calentando muy suavemente (hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse).
Nosotros lo hicimos calentando suavemente a una cierta distancia del mechero bunsen, hasta que percibimos seco el porta.
3. Fijación
Luego, una vez seco, lo fijamos utilizando calor. Para ello pasamos el porta, tres veces, por la llama del mechero.
NOTA: Se debe tener cuidado de no calentar mucho el portaobjetos. Además para la desecación y la fijación es conveniente usar unas pinzas para portaobjetos.
4. Tinción
Lo primero fue cubrir la preparación con cristal violeta (colorante primario) durante 1 min.
Pasado ese tiempo se lavó con agua destilada ligeramente.
Luego se cubre la preparación con Lugol (mordiente) durante 1 minuto.
NOTA: Este mordiente sirve para fijar los colores en los frotis coloreados. Su función es favorecer la fijación del colorante.
Se lavó, pasado el tiempo, ligeramente con agua
Luego decoloramos con decolorante (solo de15 a 20 segundos). Este reactivo solo arrastra el colorante en las bacterias G (-).
NOTA: La decoloración es la parte más complicada de la tinción de Gram ya que si se fuerza el tiempo se pueden obtener resultados erróneos.
Los lavados los realizamos con un frasco lavador
Después lavamos con mucha agua para que no queden restos de alcohol.
Por último añadimos un colorante de contraste: fue con Safranina (y lo dejamos 1 min y 30 segundos), la cual tiñe de rojo a las bacterias decoloradas, es decir las G(-) que tienen una pared celular fina.
Tras ello lavamos con agua en abundancia y dejamos secar inclinados.
Luego se observó al microscopio con el objetivo de 100x.
5. Observación
Tras conseguir enfocar con el 10x pasamos al objetivo de 100x de inmersión, conseguimos ver bacterias coloreadas de rojo, por lo que son GRAM NEGATIVAS.
(Si fueran positivas se verían de color azul)
NOTA: Cabe recordar que para la observación de bacterias se debe abrir el diafragma y con el condensador subido.
Diferenciar las bacterias en Gram (+) y Gram (-) en función de la distinta composición de su pared bacteriana
FUNDAMENTO
Emplear el uso de diversos colorantes para poder diferenciar bacterias Gram + y Gram -
Material necesario:
- Mechero Bunsen
- Portaobjetos
- Asa de platino
- Pipeta Pasteur
- Colorantes de Gram (cristal violeta, lugol, alcohol -acetona, safranina)
- agua destilada estéril
- Cristalizador, barras paralelas, frasco lavador.
- Microscopio
- Muestra de material clínico o cultivo bacteriano.
1. Extensión
Lo primero que hicimos fue colocar en un portaobjetos limpio, seco y desengrasado, una gota de agua destilada utilizando el asa de platino previamente esterilizada en un mechero bunsen.
Luego tomamos asépticamente con el asa una pequeña muestra del cultivo sólido (aureus) y mezclar con la gota de agua para obtener una suspensión. Extender la suspensión con el asa de platino previamente esterilizada y enfriada.
NOTA: También puede utilizarse un cultivo líquido, en dicho caso, la muestra se toma con el asa de platino y no es necesario colocar la gota de solución salina o de agua.
Además flameamos el asa como ya indicamos en las prácticas anteriores y siempre trabajando cerca de la llama del mechero.
Nunca debemos olvidarnos de enfriar el asa antes de coger el microorganismo.
 |
| Toma de muestra de un compañero en tubo |
 |
| Toma de muestra de Aureus |
 |
| Extendiendo la muestra con el agua |
2. Desecación
La preparación se deja secar, a temperatura ambiente o calentando muy suavemente (hay que tener mucha precaución de no calentar demasiado el porta pues las células pueden deformarse o romperse).
Nosotros lo hicimos calentando suavemente a una cierta distancia del mechero bunsen, hasta que percibimos seco el porta.
3. Fijación
Luego, una vez seco, lo fijamos utilizando calor. Para ello pasamos el porta, tres veces, por la llama del mechero.
NOTA: Se debe tener cuidado de no calentar mucho el portaobjetos. Además para la desecación y la fijación es conveniente usar unas pinzas para portaobjetos.
4. Tinción
- Colorantes que se necesitan:
- Cristal violeta
- Lugol (mordiente)
- Alcohol - acetona (diferenciador) = decolorante
- Safranina
Lo primero fue cubrir la preparación con cristal violeta (colorante primario) durante 1 min.
Pasado ese tiempo se lavó con agua destilada ligeramente.
Luego se cubre la preparación con Lugol (mordiente) durante 1 minuto.
NOTA: Este mordiente sirve para fijar los colores en los frotis coloreados. Su función es favorecer la fijación del colorante.
Se lavó, pasado el tiempo, ligeramente con agua
Luego decoloramos con decolorante (solo de15 a 20 segundos). Este reactivo solo arrastra el colorante en las bacterias G (-).
NOTA: La decoloración es la parte más complicada de la tinción de Gram ya que si se fuerza el tiempo se pueden obtener resultados erróneos.
Los lavados los realizamos con un frasco lavador
Después lavamos con mucha agua para que no queden restos de alcohol.
Por último añadimos un colorante de contraste: fue con Safranina (y lo dejamos 1 min y 30 segundos), la cual tiñe de rojo a las bacterias decoloradas, es decir las G(-) que tienen una pared celular fina.
Tras ello lavamos con agua en abundancia y dejamos secar inclinados.
Luego se observó al microscopio con el objetivo de 100x.
5. Observación
Tras conseguir enfocar con el 10x pasamos al objetivo de 100x de inmersión, conseguimos ver bacterias coloreadas de rojo, por lo que son GRAM NEGATIVAS.
(Si fueran positivas se verían de color azul)
NOTA: Cabe recordar que para la observación de bacterias se debe abrir el diafragma y con el condensador subido.
 |
| Bacterias (bacilos) Gram - vistas con 100x |
Comentarios
Publicar un comentario