PRÁCTICA 9. PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE COCOS GRAM +

12.11.2019

OBJETIVO

Con esta práctica vamos a descubrir que clase de Coco Gram + es el microorganismo que tenemos mediante la realización de diferentes técnicas que va a ir acercándonos al microorganismo en cuestión e iremos descartando otros.

FUNDAMENTO

Con ese objetivo vamos a aprender la realización de determinadas prácticas y fundamentos, como la catalasa, coagulasa, manitol, etc...

Material necesario:

Mechero bunsen
Asas de siembra estériles
Medios de cultivo
Gradillas
Pinzas
Portaobjetos

Reactivos:

Parafina
Discos de novoviocina
Suero

Además de los microorganismos.

PROCEDIMIENTO

Realizamos varias pruebas que poco a poco nos fueron llevando al microorganismo del cual se trataba. Escogimos dos muestras.

Primera prueba: Catalasa

La catalasa es una enzima, propia de las bacterias anaerobias facultativas, que descompone el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, que se desprende en forma de burbujas.
Se utiliza para diferenciar el género Staphylococcusy Micrococcus (catalasa +) del género Streptococcus (catalasa -).

Procedimiento:

-Sobre un portaobjetos depositamos una colonia de 24 h., se añade luego una gota de agua oxigenada sin mezclar con el asa y sin invertir el orden.

El inmediato desprendimiento de burbujas se considera una prueba positiva.

Las colonias se deben tomar de un medio sin sangre ya que los eritrocitos tienen actividad de catalasa y pueden falsear los resultados. También puede realizarse en tubo.

En el primer microorganismo vimos que salieron burbujas de inmediato y el segundo no, por lo que ya sabemos que uno es un Staphylococo (+) y el otro un Streptococcus (-)

Segunda prueba: Óxido - fermentación

Estudia la capacidad de los microorganismos para oxidar y/o fermentar la glucosa produciendo ácido, que se detecta por la presencia de un indicador de pH (azul de bromotimol), que vira de color verde a amarillo.
Además diferencia cocos Gram (+) entre sí.

Procedimiento:

Se siembra la muestra, en picadura, en dos tubos que contienen el medio de Hugh Leifson (O/F) adicionado de un 1% glucosa.

A uno de los tubos se añade parafina líquida estéril para conseguir anaerobiosis.

Se incubaron durante 24 -48 horas a 37 º C.

Tubo con parafina y sin parafina

Resultados:

En el tubo de epidermidis nos dio el primero positivo (amarillo) y el otro negativo (verde) lo que nos indica Micrococus, aunque no nos debía salir así pero nuestros medios no estaban en unas buenas condiciones así que posiblemente se deba a eso, por que se notaba que quería volverse ligeramente amarillo el tubo verde.

El tubo de Lutheus nos dio los dos verde, pero posiblemente sea por la mala calidad de los medios.

Tercera prueba: Fermentación del manitol.

Estudia la capacidad de los microorganismos para fermentar el manitol y crecer en presencia de una elevada concentración de NaCl (Medio de Chapman)
Cuando el microorganismo fermenta el manitol se producen metabolitos ácidos que cambian el pH del medio y el indicador (rojo fenol) vira a amarillo.
Diferencia S. aureus del resto de los estafilococos.

Lo realizamos por siembra en agotamiento de estrías.

Resultados:
En cuanto al epidermidis, no fermentó el manitol por lo que no hubo cambio de color, sin embargo en el Lutheus si ocurrió por lo que cabe la posibilidad de que el tubo de donde se encontraba estuviese contaminado por otras especies bacterianas.

Cuarta prueba: DNAsas

Estudia la capacidad que tienen algunas bacterias para producir el enzima DNAsa, que produce la degradación del DNA que contiene el medio de cultivo.
Diferencia las especies patógenas de Staphylococcus (DNAsa +) de las no patógenas (DNAsa -).

Procedimiento:

En una placa que contiene Agar DNAsa, se siembra la muestra, haciendo una estría de unos 2 cm.
Se incuba 24horas /37ºC.
Se hace la lectura añadiendo ácido HCl 1 N (que precipita el DNA), o azul de toluidina al 1%, y observando la aparición de zonas claras o coloreadas de rosa, respectivamente, alrededor de la zona sembrada.

Al siguiente día se le añadió HCl en la DNAsa, si vira será un aureus, pero como los nuestros son lutheus y epidermidis no debe virar ninguno.

Quinta prueba: Coagulasa

Estudia la capacidad del microorganismo para producir el enzima coagulasa que origina la coagulación del plasma humano.

Diferenciar S. aureus (coagulasa +) de los otros Staphylococcus (coagulasa -)

Procedimiento:

Se puede hacer en porta y en tubo
-En tubo: Se emulsionan bastantes colonias en un tubo de ensayo con 0,5ml de plasma citratado. Se incuba a 37º C y se observa la formación del coágulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la noche y se procede a su lectura a las 18 –24horas.

Resultados:

Se observa la formación de un coágulo total o parcial cuando la prueba es positiva. Como esta solo la hicimos con epidermidis dio negativo

Sexta prueba: Sensibilidad a la novobiocina

Algunas especies del género Staphylococcusson resistentes a la novobiocina.
Diferencia S.saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos.

Procedimiento:

Se realiza una siembra en masa y tras ello se pone con ayuda de unas pinzas un disco de novobiocina y se eerce un poco de presión

Resultado: Un halo de inhibición de crecimiento, menor o igual a 16mm, corresponde a S. saprophyticus.
Un halo de inhibición mayor de 16mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos.
La no aparición de halo de inhibición de crecimiento indica resistencia a novobiocina.