PRÁCTICA 11: PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA COCOS GRAM NEGATIVOS
13.12.19
PRÁCTICA 1: OXIDASA
OBJETIVO
Diferenciar géneros Neisseria y Moraxella (+) de Acinetobacter (-)
FUNDAMENTO
PROCEDIMIENTO
Depositamos en un portaobjetos un papel de filtro y sobre él 3 gotas de reactivo de Kovacs y seguidamente coger con un asa de siembra estéril el microorganismo Pseudomonas y realizar una extensión en el reactivo.
Como es oxidasa + vimos que apareció un color azul, lo que indica que es oxidasa +.
PRÁCTICA 2: FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
OBJETIVO
FUNDAMENTO
Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas, con frecuencia, fermentan los carbohidratos produciendo ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2) que se detectan mediante un indicador de pH y una campana Durham.
Material necesario:
PROCEDIMIENTO:
Preparación del medio.
Primero pesamos 1,5 g de rojo fenol y lo echamos en 100 mL de agua destilada, por otra parte pesamos 0,2 g de glucosa y lo echamos en 10 mL de agua ( para conseguirla al 2 %), mezclamos y la pusimos 2 minutos en el microondas los cuales fueron suficientes.
Lo dejemos enfriar un poco y vertimos 5 mL del caldo a un tubo y luego se echo la campana de Durham inclinando ligeramente el tubo para que no quede flotando
Inoculación
Seguidamente inoculamos la bacteria (la bacteria que empleamos fue Kliebsela) en el medio líquido que hemos preparado, la siembra se realiza casi hasta el fondo del tubo sin tocar las paredes y moviéndolo un poco, luego sacar con cuidado de no mover mucho la campana de Durham.
Seguidamente metimos todos los tubos de clase en la estufa y se observaron los resultados varios días después.
Primero depositamos un disco de ONPG en un tubo de ensayo con 1 ml de solución salina estéril.
Inoculamos una colonia.
Incubamos 24h.a 37ºC
Los posibles resultados son los siguientes:
PRÁCTICA 1: OXIDASA
OBJETIVO
Diferenciar géneros Neisseria y Moraxella (+) de Acinetobacter (-)
FUNDAMENTO
Se basa en la capacidad que tienen ciertos microorganismos de producir el enzima citocromo-oxidasa, que cataliza en la cadena respiratoria la transferencia de electrones desde un sustrato orgánico hasta el oxígeno.
Para poner de manifiesto este enzima se utiliza se utiliza como indicador un compuesto (reactivo de Kovac´s) que se oxida en presencia de citocromo oxidasa transformándose en un producto coloreado.
Material necesario:- Portaobjetos
- Papel de filtro
- Mechero bunsen
- Asa de siembra
- Reactivo de Kovacs
Muestra:
- Pseudomonas
Depositamos en un portaobjetos un papel de filtro y sobre él 3 gotas de reactivo de Kovacs y seguidamente coger con un asa de siembra estéril el microorganismo Pseudomonas y realizar una extensión en el reactivo.
Como es oxidasa + vimos que apareció un color azul, lo que indica que es oxidasa +.
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Se puede ver tras la extensión la aparición
de color azul
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PRÁCTICA 2: FERMENTACIÓN DE AZÚCARES
OBJETIVO
Diferenciar las especies (sobre todo en las bacterias entéricas), se pueden utilizar diferentes
azúcares (glucosa, maltosa, lactosa, etc) como sustrato.
FUNDAMENTO
Las bacterias anaerobias y anaerobias facultativas, con frecuencia, fermentan los carbohidratos produciendo ácidos orgánicos y gas (H2 o CO2) que se detectan mediante un indicador de pH y una campana Durham.
Material necesario:
- Probeta
- Balanza
- Embudo
- Matraz erlenmeyer
- Microondas
- Varilla
- Gradilla
- Tubos de ensayo
- Micropipeta de 5000 µL
- Rojo fenol
- Glucosa
Muestra:
- Kliebsela
PROCEDIMIENTO:
Preparación del medio.
Primero pesamos 1,5 g de rojo fenol y lo echamos en 100 mL de agua destilada, por otra parte pesamos 0,2 g de glucosa y lo echamos en 10 mL de agua ( para conseguirla al 2 %), mezclamos y la pusimos 2 minutos en el microondas los cuales fueron suficientes.
Lo dejemos enfriar un poco y vertimos 5 mL del caldo a un tubo y luego se echo la campana de Durham inclinando ligeramente el tubo para que no quede flotando
Inoculación
Seguidamente inoculamos la bacteria (la bacteria que empleamos fue Kliebsela) en el medio líquido que hemos preparado, la siembra se realiza casi hasta el fondo del tubo sin tocar las paredes y moviéndolo un poco, luego sacar con cuidado de no mover mucho la campana de Durham.
Seguidamente metimos todos los tubos de clase en la estufa y se observaron los resultados varios días después.
- Si no fermenta carbohidratos no cambia de color y no produce gas.
- Fermenta carbohidratos, vira a amarillo y no forma gas.
- Fermenta carbohidratos, vira a amarillo y forma gas.
Pasados unos días observamos los tubos y el nuestro viró a amarillo pero no había formación de gases. Por o que el microorganismo fermenta la glucosa
PRÁCTICA 3: BETA GALACTOSIDASA (ONPG)
OBJETIVO
Diferenciar a Neisseria lactámica de otras especies de Neisseria.
Diferenciar Enterobacterias:
Que dan positiva la prueba: E. Coli, Klebsiella, Aerobacter y Enterobacter,
Que dan negativa la prueba: Proteus, Salmonella, Shigella y Pseudomonas.
FUNDAMENTO
Determinar la capacidad de algunas bacterias, que poseen el enzima β -galactosidasa, para fermentar la lactosa originando glucosa y galactosa.
Para realizar la prueba se añade un sustrato artificial, ONPG (ortonitrofenilgalactósido), que al ser hidrolizado por la β-galactosidasa origina un compuesto de color amarillo
Material necesario:
- Tubo de ensayo
- Pinzas
- Mechero bunsen
- Estufa
Reactivos:
Muestra:
- SSF
- Disco de ONPG
Kiebsella
PROCEDIMIENTOPrimero depositamos un disco de ONPG en un tubo de ensayo con 1 ml de solución salina estéril.
Inoculamos una colonia.
Incubamos 24h.a 37ºC
Los posibles resultados son los siguientes:
- Prueba positiva: Color amarillo debido a la presencia de β-Galactosidasa.
- Prueba negativa: No hay cambio de color (no hay β-Galactosidasa).
Pasados varios días observamos el aspecto de nuestro tubo y vimos que viró a amarillo.
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